噻唑蓝溴化四唑 MTT 5g

MTT噻唑蓝

别名

噻唑蓝溴化四唑; Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide

英文名称

Thiazolyl blue tetrazolium bromide

CAS:298-93-1

外观(性状)

黄色粉末

溶解性

0.5% in 1×PBS

纯度

≥98%，Ultra Pure Grade

储存条件

2-8℃，avoid light，5 years

产品信息

分子式

C18H16BrN5S

分子量

414.32

生化研究中酶活力的测定，也可用于细胞增殖检测。

特性：纯度(%)：>98.0 溶解性：溶于甲醇和DMSO，微溶于水

实验原理

噻唑蓝，简称MTT。细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 (DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

实验步骤

DAY 1

1. 对前一天培养好的处于对数期的细胞消化、离心、计数。

2. 在96孔板上接种100μL 3k-7k/孔的细胞，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养24小时。

DAY 2

1. 在显微镜下观察细胞生长状态和密度，取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔进行实验。

2. 配制不同浓度梯度的样本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14μM。每个浓度三个复孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养适当时间长度。如6，12，24或48小时。

DAY 3/4

1. MTT使用前在室温下解冻并离心 (一般MTT检测试剂盒中包含MTT粉末、MTT溶剂和甲臜增溶溶液三种组分，不同厂家的试剂盒可能略有差异。在实验前，需要将MTT溶剂加入到MTT粉末中配制成5mg/mL的MTT溶剂，用不完的可以放-20℃冰箱保存)。

2. 用倒置显微镜检测细胞生长状态，并用4X/10X取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔拍照记录。

3. 在每孔中加入10μL MTT溶液，使终浓度为0.5mg/mL。

4. 在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养4小时。

5. 小心地吸取孔中全部上清液，防止单层细胞破裂。

6. 每孔加入100μL甲臜增溶溶液。

7. 将板子放在振荡器上以300rpm/min震荡10min使甲臜全部溶解。

8. 用酶标仪在570nm处测量吸光度。

9. 用Excel及Graphpad Prism处理并分析结果。

注意事项

1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和细胞达到实验要求的培养时间，这是因为不同的细胞生长速度不同。

2. 接种时细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致，最好一人接种，一人辅助混匀。

3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基、PBS或水。

4. 药物样本初筛时可以适当减少浓度梯度的数量，增大浓度梯度间的倍数。若要确定样本的IC50则需要增加浓度梯度的数量，一般8-12个足矣。若有文献参考，则根据文献设置浓度梯度。

5. 加入样本时要注意溶解样本的培养基中血清浓度对样本的影响，部分样本可能受血清影响较大，此时需使用无血清培养基溶解样本。

6. 加样本前，要先吸出前面的培养基，但不可长期搁置防止细胞死亡，最好一块板吸完，立即加入配好的不同浓度的样本。

7. 溶解样本后最好额外分装一管，以备后续二次实验或因试验操作失误损失一次样本，二次随取随用，也避免样本的反复冻融。

8. 板子上要写好标记，板子和板盖都要写上序号，尽量避免写在孔上。

9. 加入MTT溶液时需要避光，并且此过程需要大量枪头，尽量提前准备好。

10. MTT有致癌性，实验时做好各种防护。

11. 用排枪将上清液去除时，不可触碰到底部细胞，可略微将枪头触碰底面并倾斜板身，一次性将上清液全部吸出。

12. 为了节省甲臜增溶溶液，可以每次从瓶中倒出一半到加样槽中。

13. 设置实验孔 (含有细胞的培养基、MTT、待测物质)
阴性对照孔 (含有细胞的培养基、MTT、不含待测物质)
阳性对照孔 (含有细胞的培养基、MTT、阳性对照样本)
空白孔 (不含细胞和待测物质的培养基、MTT)

14. 实验结果计算公式：

细胞存活率=[(实验孔-空白孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%

抑制率=[(阴性对照孔-实验孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%

重要提示

产品用途：仅供研究使用，不适用于人或动物的体外诊断与治疗。

由于实验受多种因素影响具有不确定性，本说明书操作说明仅供参考，最终解释权归本公司所有。

警告！产品对人体危害性未知，请遵循操作说明。穿戴适当的防护眼镜、衣服和手套！