嘌呤霉素 100mg

  嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

  嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。

  嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。

溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。

别名

二盐酸嘌呤霉素；嘌呤霉素盐酸盐

英文名称Puromycin

CAS 58-58-2

分子式 C22H29N7O5·2HCl

分子量 544.44

储存条件

-20℃，有效期4年

外观(性状)

白色至浅黄色粉末

纯度

≥99%

核心作用与机制

• 作用靶点：细菌、真菌及哺乳动物细胞的核糖体。

• 作用机制：嘌呤霉素的化学结构与氨酰 - tRNA（参与蛋白质合成的转运分子）相似，可竞争性结合核糖体的 A 位点，干扰肽链延长，导致不完整的多肽链提前释放并附着在核糖体上，最终抑制细胞蛋白质合成，导致细胞死亡（对原核和真核细胞均有杀伤作用）。

• 筛选原理：当细胞被导入含嘌呤霉素抗性基因（如 pac 基因） 的载体后，抗性基因表达的蛋白可特异性灭活嘌呤霉素，使细胞在含嘌呤霉素的培养基中存活；而未成功转染的细胞因无抗性，会被嘌呤霉素杀死，从而实现阳性细胞的筛选。

使用方法

1.建议使用浓度

哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定；

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。

2.溶解方法

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。

3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。

1） Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜；

2） Day 2：a）准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；b）往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基；之后37℃孵育细胞；

3） Day 4：更换新鲜的筛选培养基，并观察细胞存活率。

4） 根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

5） 每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非转导细胞的药物最低浓度。

4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选

等转染含有pac基因的质粒后，细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖，以筛选出稳定转染子。

1）细胞转染48h后，将细胞（原样或稀释）置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。

注意：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。

2）每隔2-3天，移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。

3）筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间，这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。

4）转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中，用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）嘌呤霉素为有毒化合物，操作时请小心拿放。

产品仅供研究使用，不适用于人或动物的体外诊断与治疗。

由于实验受多种因素影响具有不确定性，以上说明仅供参考，最终解释权归本公司所有。

适用场景

1. 稳定转染细胞株的筛选：

• 是最核心的应用场景。在质粒转染、病毒感染（如慢病毒、逆转录病毒）等介导的外源基因导入后，通过在培养基中添加嘌呤霉素，淘汰未整合外源基因的细胞，富集并获得稳定表达目的基因的单克隆细胞株（如肿瘤细胞、干细胞、CHO 细胞等）。

2. 阳性细胞的维持与纯化：

• 筛选得到稳定株后，需在传代培养中维持低浓度嘌呤霉素，防止细胞丢失抗性基因（避免抗性基因沉默或丢失导致的细胞死亡），确保细胞株的稳定性。

3. 瞬时转染的辅助筛选：

• 部分瞬时转染实验中，可短期使用低浓度嘌呤霉素快速排除未转染细胞，提高后续实验（如蛋白检测、功能分析）中阳性细胞的比例。

4. 细胞融合与杂交瘤筛选：

• 在杂交瘤技术中，可与 HAT 培养基联合使用，辅助筛选成功融合的杂交瘤细胞（需结合特定抗性基因设计）